DUNIA MIKROBIOLOGI

 

1.      Keanekaragaman Mikroorganisme dalam Media Pemeliharaan

Mikroorganisme merupakan istilah yang digunakan untuk menyebut organisme berukuran mikroskopis, seperti bakteri, sianobakter, kapang mikroskopis, protozoa dan lain sebagainya. Bakteri merupakan salah satu organisme uniseluler berukuran kecil yang termasuk golongan prokariotik. Sel-sel bakteri sangat khas dengan berbagai bentuk, seperti bulat, batang, oval dan spiral. Bakteri memiliki diameter 0,5-1,0 μm dan panjang 1,5-2,5 μm, sehingga tidak bisa diamati tanpa bantuan mikroskop. Alongi dalam Feliatra (2001) menyatakan bahwa bakteri terdapat hampir di seluruh ekosistem dan bertanggung jawab untuk mendegradasi dan mendaur ulang unsur atau elemen esensial, sehingga bakteri menjadi salah satu organisme utama dalam suatu ekosistem.

Bakteri mudah ditemukan di air, udara dan tanah. Mereka hidup dalam suatu koloni, baik bersimbiose, bebas ataupun parasit pada makhluk hidup. Jumlah bakteri di alam sangat melimpah dengan keragaman yang sangat tinggi (Pelczar dan Chan, 2005). Untuk mempelajari kehidupan dan keragaman bakteri, diperlukan suatu usaha untuk mengembakbiakkan mereka dalam skala laboratorium. Pengembangbiakan ini dilakukan dengan menumbuhkan bakteri dari sumber isolat, seperti tanah, udara, sisa makanan, dll, dalam media yang mengandung nutrisi.

Media pertumbuhan bakteri sangat beragam, mulai dari media selektif, media penyubur, media diferensial, dll. Masing-masing media memiliki fungsi berbeda dan digunakan tergantung tujuan dari praktikan. Berikut adalah syarat yang harus dipenuhi media :

a.       Mengandung nutrisi yang dibutuhkan oleh mikroorganisme yang sedang   dikembangkan.

b.      Memiliki kelembaban optimum bagi pertumbuhan mikroorganisme.

c.       Mengandung oksigen (kultur bakteri aerob) dan pH yang sesuai.

d.      Harus bebas dari mikroba lain dan steril

Ada 3 jenis media pengembangbiakan berdasarkan konsistensinya, antara lain :

a.       media padat, yaitu media berbentuk padat yang mengandung agar 1-1.5%, misalnya nutrien agar

b.      media cair, yaitu media berbentuk cair yang tidak mengandung agar, misalnya nutrien broth.

c.       media semi padat, yaitu media yang berbentuk padat pada suhu dingin, dan berbentuk cir bila suhu panas, misalnya media SIM (media yang digunakan untuk uji produksi sulfur, indol, motilitas)

Berdasarkan komposisi penyusunnya, media dibedakan menjadi 2, yaitu media sintetis dan media non-sintetis. Media sintetis adalah media yang telah diketahui susunan kimia nutrisinya, seperti media pepton agar yang terbuat dari pepton, agar dan NaCl, sedangkan media non-sintetis, yaitu media yang belum diketahui susunan kimia nutrisinya, seperti kentang, wortel, kaldu, dll.

2.      Pembiakkan Mikroorganisme (Bakteri)

Dalam dunia mikrobiologi, dikenal beberapa istilah seperti inokulasi, kultur dan isolasi. Inokulasi adalah suatu usaha menumbuhkan mikroorganisme dari satu sumber ke media pertumbuhan steril. Biakan yang tumbuh disebut dengan kultur. Isolat adalah biakan murni dari mikroorgansime yang diharapkan berasal dari satu jenis, sedangkan isolasi adalah usaha untuk mendapatkan isolat.

Sumber isolasi → Inokulasi → Kultur/biakan → Isolasi → Isolat

Tahapan sederhana dalam mengidentifikasi bakteri, yaitu :

1.      Menumbuhkan mikroorganisme dalam media sintetik cawan petri

2.      Koloni yang tumbuh pada tahap 1 merupakan koloni campuran, sehingga perlu tahap lanjut.

3.      Koloni yang benar-benar terpisah dari suatu kultur campuran dikarakterisasi tipe pertumbuhan (karakterisasi makroskopis) kemudian diisolasi murni pada media miring (slant agar) dalam tabung reaksi.

4.      Identifikasi dilanjutkan hingga tingkat mikroskopis berdasarkan sifat-sifat tertentu yang tercantum dalam Bergey`s Manual of Determinative Bacteriology

Dalam mengembangbiakkan mikroorganisme, khususnya bakteri, alat-alat yang digunakan harus steril. Sterilisasi dilakukan dengan memanaskan seluruh alat, seperti cawan petri, ose, tabung reaksi, dll di dalam autoclave. Sebenarnya, sterilisasi adalah masalah teknis yang terkdang tidak ditemukan dalam literatur. bahkan, informasi mengenai cara sterilisasi saya dapatkan dari kakak angkatan, laboran dan rekan sekerja di lab. Oleh karena itu, sebaiknya mahasiswa memiliki koneksi dengan salah satu dari mereka, sehingga mendapatkan informasi yang sangat penting apabila ingin bekerja di laboratorium, khususnya mikrobiologi. Sterilisasi dilakukan pada suhu 121oC, tekanan 1 atm dan dilakukan selama 15 menit. Ini dilakukan gar sel-sel vegetatif bakteri mati, sehingga dapat menurunkan resiko kontaminasi. Sterilisasi juga menjadi syarat utama untuk bekerja di laboratorium.

autoclave di laboratorium mikrobiologi UNY

Membiakkan bakteri dapat dilakukan dengan berbagi cara, salah satunya pengembangbiakan dalam media cawan petri. Pengembangbiakan dalam cawan ini ada beberapa metode, yaitu :

1.      Metode cawan gores (streak plate)

Metode cawan gores cukup sulit bagi pemula, terutama mahasiswa semester awal yang baru mengambil mata praktikum mikrobiologi. Kesulitan dari metode ini, yaitu proses penggoresan yang cukup lama dan sulit, sehingga memudahkan terjadinya kontaminasi dan kegagalan. Prinsip metode ini, yaitu mendapatkan koloni yang benar-benar terpisah dari koloni yang lain, sehingga mempermudah proses isolasi.

Cara ini dilakukan dengan membagi cawan petri menjadi 3-4 bagian. Ose steril yang telah disiapkan dilekatkan pada sumber isolat, kemudian menggoreskan ose tersebut pada cawan berisi media steril. Goresan dapat dilakukan 3-4 kali membentuk garis horisontal di satu sisi cawan. Ose disterilkan lagi dengan api bunsen, setelah kering ose tersebut digunakAn untuk menggores goresan sebelumnya pada sisi cawan kedua. Langkah ini dilanjutkan hingga keempat sisi cawan tergores.

Pada metode ini, goresan di sisi pertama diharapkan koloni tumbuh padat dan berhimpitan, sedangkan pada goresan sisi kedua, koloni mulai tampak jarang dan begitu pula selanjutnya, sehingga didapatkan koloni yang tampak tumbuh terpisah dengan koloni lain. Seluruh tahap hendaknya dilakukan secara aseptik agar tak terjadi kontaminasi.

2.      Metode cawan tuang (pour plate)

Metode cawan tuang sangat mudah dilakukan karena tidak membutuhkan keterampilan khusus dengan hasil biakan yang cukup baik. Metode ini dilakukan dengan mengencerkan sumber isolat yang telah diketahui beratnya ke dalam 9 ml garam fisiologis (NaCl 0.85%) atau larutan buffer fosfat. Larutan ini berperan sebagi penyangga pH agar sel bakteri tidak rusak akibat menurunnya pH lingkungan. Pengenceran dapat dilakukan beberapa kali agar biakan yang didapatkan tidak terlalu padat atau memenuhu cawan (biakan terlalu padat akan mengganggu pengamatan).

Sekitar 1 ml suspensi dituang ke dalam cawan petri steril, dilanjutkan dengan menuangkan media penyubur (nutrien agar) steril hangat (40-50oC) kemudian ditutup rapat dan diletakkan dalam inkubator (37oC) selama 1-2 hari.

Penuangan dilakukan secara aseptik atau dalam kondisi steril agar tidak terjdi kontaminasi atau tumbuh atau masuknya organisme yang tidak diinginkan (di laboratorium, kontaminasi biasanya terjadi akibat tumbuhnya kapang, seperti Penicilium dalam biakan). Media yang dituang hendaknya tidak terlalu panas, karena selain mengganggu proses penuangan (media panas sebabkan tangan jadi panas juga), media panas masih mengeluarkan uap yang akan menempel pada cawan penutup, sehingga mengganggu proses pengamatan. pada metode ini, koloni akan tumbuh di dalam media agar. Kultur diletakkan terbalik, dimasukkan di dalam plastik dengan diikat kuat kemudian diletakkan dalam inkubator

3.      Metode cawan sebar (spread plate)

Pada metode cawan sebar, 0.1 ml suspensi bakteri yang telah diencerkan (metode 3) disebar pada media penyubur steril yang telah disiapkan. Selanjutnya, suspensi dalam cawan diratakan dengan batang drygalski agar koloni tumbuh merata pada media dalam cawan tersebut, kemudian diletakkan dalam inkubator (37oC) selama 1-2 hari. Metode ini cukup sulit terutama saat meratakan suspensi dengan batang drygalski. Alih-alih koloni tumbuh merata, biakan justru terkontaminasi. Oleh karena itu, batang drygalski harus benar-benar steril, yaitu dengan mencelupkannya terlebih dahulu dalam alkohol kemudian dipanaskan dengan api bunsen. Perlu diingat, batang drygalski, yang masih panas akibat pemanasan dengan api bunsen, dapat merusak media agar, sehingga harus didinginkan terlebih dahulu dengan meletakkannya di sekitar api bunsen (±15 cm).

Dengan metode ini, satu sel bakteri akan tumbuh dan berkembang menjadi satu koloni bakteri. Satu koloni bakteri yang terpisah dengan koloni lainnya dapat diamati tipe pertumbuhan pada masing-masing media, diantaranya dilakukan terhadap konsistensi, bentuk koloni, warna koloni dan permukaan koloni.

Koloni yang tumbuh terpisah ditumbuhkan kembali untuk mendapatkan isolat murni. Isolasi murni dilakukan dengan mengoleskan ose steril pada koloni dalam kultur campuran yang benar-benar terpisah satu sama lain. Olesan tersebut digores pada media padat agar miring dalam tabung reaksi.

Koloni yang tumbuh dalam media ini merupakan isolat murni, yang hanya berasal dari satu jenis bakteri saja. Koloni yang tumbuh dapat dikarakerisasi berdasarkan tipe pertumbuhannya pada media agar miring.

Seluruh kultivasi atau penanaman sebaiknya dilakukan di dalam laminar air flow yang tertutup, untuk mengurangi resiko kontaminasi. LAF dilengkapi dengan lampu fluorescent, sinar UV dan kipas angin. Lampu fluorescent digunakan apabila kondisi cahaya di dalam LAF dan kamar isolasi kurang memadai. Sinar UV bersifat germisida yang dapat membunuh bakteri yang tidak diinginkan, sehingga dapat menurunkan resiko kontaminasi. Sebelum penanaman (kultivasi), alat2 yang digunakan sebaiknya dikenai sinar UV selama 5 menit (ingat, hanya alat2, seperti lampu bunsen, ose, pipet, dll).

laminar air flow di laboratorium mikrobiologi UNY

3.      Karakterisasi Mikroskopis dan Identifikasi

Karakterisasi merupakan langkah awal dalam mengidentifikasi bakteri. Karakterisasi dilakukan untuk mendapatkan ciri khas dari isolat, sehingga dapat diketahui jenisnya. Karakterisasi bakteri dilakukan melalui dua tahap, yaitu karakterisasi makroskopis, meliputi tipe pertumbuhan pada berbagai media dan karakterisasi mikroskopis, yaitu karakterisasi bentuk sel, ukuran, dsb.

Karakterisasi untuk bakteri dilakukan pula terhadap aktivitas metabolisme, seperti kebutuhan akan sumber energi, kebutuhan oksigen, sifat fermentasi, produksi senyawa tertentu, dsb. Hasil karakterisasi kemudian disesuaikan dengan bakteri acuan dalam Bergey`s Manual of Determinative Bacteriology (9th ed.). Metode ini disebut dengan matching profile atau metode kesamaan profil (sifat) antara isolat dengan bakteri acuan. Tentu saja bakteri yang ditemukan belum pasti bakteri yang sama dengan acuan. Maksudnya, isolat yang didapatkan hanya diduga sebagai bakteri yang dijadikan acuan. Dalam skripsipun harus dituliskan `isolat yang didapatkan diduga merupakan bakteri A berdasarkan sifat-sifat yang dimiliki oleh bakteri A berdasarkan Bergey`s Manual of Determinative Bacteriology.